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实验三 蛋白质脱盐(透析和凝胶过滤)

发布时间:2019-07-25 18:09 来源:未知 编辑:admin

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  实验三 蛋白质脱盐(透析和凝胶过滤) Ⅰ。蛋白质的透析 实验目的 学习透析的基本原理和操作 实验原理 蛋白质是大分子生物,它不能透过透析膜而小分子物质可以自由透过。 在分离提纯蛋白质的过程中,常利用透析的方法使蛋白质与其中夹杂的小分子物质分 开。 实验器材 1、透析管或玻璃纸 2、烧杯 3、玻璃棒 4、电磁搅拌器 5、试管及试管架 6、离心机 7、冰箱 8、电炉 实验试剂 1、1%氯化钡溶液 2、硫酸铵粉末 3、1mol/L EDTA 4、2% NaHCO3 实验材料 1.透析管(宽约 2.5cm,长 12~15cm)或玻璃纸 2.皮筋 3.鸡蛋清溶液: 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按 1:20 混匀,然后用六层纱布过滤。 实验操作 1、透析管(前)处理:先将一适当大小和长度的透析管放在 1mol/L EDTA 溶液中,煮沸 10min 再在 2% NaHCO3 溶液中煮沸 10min,然后再在蒸馏水中煮沸 10min 即可。 2、加 5ml 蛋白质溶液于离心管中,加 4g 硫酸铵粉末,边加边搅拌,使之溶解。然后在 4℃ 下静置 20min,出现絮状沉淀。 3、离心:将上述絮状沉淀液以 1000r/min 的速度离心 20min 4、装透析管:离心后倒掉上清液,加 5ml 蒸馏水溶解沉淀物,然后小心倒入透析管中,扎 紧上口。 5、将装好的透析管放入盛有蒸馏水的烧杯中,进行透析,并不断搅拌。 6、每隔适当时间(5~10min),用氯化钡滴入烧杯的蒸馏水中,观察是否有沉淀现象。 结果处理 记录并解释实验现象。 注意事项 硫酸铵盐一定要充分溶解,才能使蛋白质沉淀下来。 思考题 在透析袋处理过程中,EDTA 和 NaHCO3 起何作用? Ⅱ.凝胶过滤 实验目的 学习凝胶过滤的基本操作技术,了解凝胶过滤脱盐的原理和应用。 实验原理 凝胶过滤的主要装置是填充有凝胶颗粒的层析柱。目前使用较多的凝胶是交联葡聚糖凝 胶(sephadex)。这种高分子材料具有一定孔径的网络结构。高度亲水,在水溶液里吸水显 著膨胀。用每克干胶吸水量(ml)的 10 倍(G 值)表示凝胶的交联度,可根据被分离物质 分子的大小和工作目的,选择适合的凝胶型号。交联度高的小号胶如 Sephadex G-25 适于脱 盐。 当在凝胶柱顶加上分子大小不同的混合物并用洗脱液洗脱时,自由通透的小分子可以进 入胶粒内部,而受排阻的大分子不能进入胶粒内部。二者在洗脱过程中走过的路程差别较大, 大分子只能粘着胶粒之间的间隙向下流动,所经路程短,最先流出。而渗入胶粒内部的小分 子受迷宫效应影响,要经过层层扩散向下流动,所经路程长,最后流出。通透性居中的分子 则后于大分子而先于小分子流出。从而按由大到小的顺序实现大小分子分离。 凝胶过滤的操作条件温和,适于分离不稳定的化合物;凝胶颗粒不带电荷,不与被分离 物质发生反应,因而溶质回收率接近 100%,而且设备简单、分离效果好、重现性强,凝胶 柱可反复使用,所以广泛使用于蛋白质等大分子的分离纯化,分子质量测定、脱盐等用途。 本实验利用凝胶过滤的特点将(NH4)2SO4 同蛋白质分子分离开。 实验仪器 1、层析柱(2cm×15cm) 2、线、记录仪 实验试剂 1、1%氯化钡溶液 2、硫酸铵粉末 实验材料 1、Sephadex G-25 2、鸡蛋清溶液: 将新鲜鸡蛋的蛋清与水按 1:20 混匀,然后用六层纱布过滤。 操作步骤 1、 凝胶溶胀:取 5g Sephadex G-25,加 200ml 蒸馏水充分溶胀(在室温下约需 6h 或在沸水 浴中溶胀 2h)。待溶胀平衡后,用虹吸法除去细小颗粒,再加入与凝胶等体积的蒸馏水, 在真空干燥器中减压除气,准备装柱。 2、 装柱:将层析柱垂直固定,加入 1/4 柱长的蒸馏水。把处理好的凝胶用玻棒搅匀,然后 边搅拌边倒入柱中(柱口保持排放)。最好一次连续装完所需的凝胶,若分次装入,需 用玻棒轻轻搅动柱床上层凝胶,以免出现界面,影响分离效果。最后放入略小于层析柱 内径的滤纸片,保护凝胶床面。 3、 平衡:继续用蒸馏水洗脱,调整流量,使胶床表面保持 2cm 液层,平衡 20min。 4、 样品制备:取 5ml 蛋白质溶液于离心管中,加 4g 硫酸铵粉末,边加边搅拌,使之溶解。 然后在 4℃下静置 20min,出现絮状沉淀。将上述絮状沉淀液以 1000r/min 的速度离心 20min.离心后倒掉上清液,加 5ml 蒸馏水溶解沉淀物,即为样品。 5、 上样:当胶床表面仅留约 1mm 液层时,吸取 1ml 样品,小心的注入层析柱胶床面中央, 慢慢打开螺旋夹,待大部分样品进入胶床,床面上仅有 1mm 液层时,用乳头滴管加入 少量蒸馏水,使剩余样品进入胶层,然后用滴管小心加入 3cm~5cm 高的洗脱液。 6、 洗脱:继续用蒸馏水洗脱,调整流速,使上下流速同步。用核酸蛋白检测仪检测,同时 用部分收集器收集洗脱液。合并与峰值相对应的试管中的洗脱液,即为脱盐后的蛋白质 溶液。 7、 用氯化钡溶液检测蛋白质溶液和其他各管收集液,评价脱盐效果。 结果处理 记录并解释实验现象,讨论凝胶过滤的脱盐效果。 注意事项 1、 整个操作过程中凝胶必须处于溶液中,不得暴露于空气,否则将出现气泡和断层,应当 重新装柱。 2、 加样时,应小心注入床面中央,注意切勿冲动胶床。 思考题 影响凝胶过滤脱盐效果的因素有哪些?

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